Csak néhány hónappal azután, hogy a tudósok dekódolták a Drosophila (gyümölcslégy) genom teljes szekvenciáját, az Országos Általános Orvostudományi Intézet által finanszírozott biológuspáros újabb jelentős mérföldkövet ért el: a gyümölcslégy "kiütésének" képességét. gének.
"Ez az, amit a Drosophila tudósai 20 éve meg akartak tenni" - mondta Dr. Kent Golic, a Utah-i Egyetem munkatársa, aki az eredményeket a Science június 16-i számában publikálta Dr. Yikang Rong posztdoktori munkatársával együtt..
Az úgynevezett "kiütéses" technológia egy hatékony laboratóriumi módszer, amelyet rutinszerűen alkalmaznak bizonyos más modellrendszerekkel, például élesztővel és egerekkel dolgozó tudósok. A technológia azonban nagyon hiányzott világszerte több ezer kutatónak, akik gyümölcslegyeket használnak kutatási eszközként a növények és állatok, köztük az emberek biológiájának rejtélyeinek feltárására.
Az új technika lehetővé teszi a légykutatók számára, hogy szétszedjék a gyümölcslégy genomjában található 13 601 gén funkcióit. Fontos génjei révén a Nature kitűnő gazdaságossági érzékről tett tanúbizonyságot: a 289 emberi gén közül 177-nek, amelyekről ismert, hogy „hibásan írják” megbetegedéseket okoznak az emberekben, közvetlen megfelelői vannak a légyben.
A légygenetikusok évtizedek óta keresztezték a legyek törzseit, hogy tanulmányozzák génjeiket. Eddig azonban a tudósok nem tudták megcélozni egy adott légygént a gén letiltásával vagy „mutációjával”.
Az új munkának köszönhetően ezek a tudósok most ezt teszik.
Dr. Golic szerint a légygének kiiktatása korántsem volt biztos. "Egyáltalán nem volt világos, hogy ez működni fog… azon kapkodtuk a fejünket, hogyan találjunk pénzt ezekre a kísérletekre" - mondta.
Dr. Golic pénze egy speciális NIGMS finanszírozási programból származott, amely a "nagy kockázatú, nagy hatású" támogatásokat vagy R21-et, ahogy a NIGMS-nél hívják. Az R21 által finanszírozott kutatási projektek olyan magas kockázatú kísérleteket foglalnak magukban, amelyek gyakran kevés alátámasztó adattal rendelkeznek, de ha sikeresek, jelentős tudományos eredményük lenne.
Dr. Paul Wolfe, a NIGMS molekuláris biológusa szerint A gyümölcslégy gének kiiktatása megfelel a célnak. "Ez a sikeres R21 kiváló példája" - mondta.
Ez az egyik oka annak, hogy a légykutató közösség olyan sokáig nélkülözi a knock-out technológiát – tette hozzá Dr. Wolfe. "Senki sem akart belevágni és kockáztatni" - mondta. "Kent Golic megtette, és működött."
Knocking Fly Genes Around
A kutatók jellemzően kiütéses technológiát alkalmaznak olyan "mutáns" organizmusok létrehozására, amelyek egy adott gén hibásan írt, ezért inaktív változatát tartalmazzák, amely befolyásolja a viselkedést vagy más jellemzőket, például a szőrzet színét. A módszer lehetővé teszi a kutatóknak, hogy lássák, mi történik, ha a gén hiányzik.
De Dr. Golic technikája mindkét irányba haladhat – módszere a hibás gének kijavítására is használható, vagy „beütheti őket”, ha egy hibás gént helyesen írt génre cserél. Ez a génterápia alapjául szolgáló alapelv – az a képesség, hogy megszabaduljunk egy gén „rossz” másolatától, és helyettesítsük azt a „helyes” másolattal.
Valójában ez az, amit Drs. Golic és Rong a gyümölcslegyekkel foglalkozott, a "sárgának" nevezett légytestszín génnel dolgoztak. A két tudós halvány színű legyek egy könnyen felismerhető törzsét vette át, amelyekről ismert, hogy a testszín génben elírásuk van, ami barnás-fekete árnyalatot ad a normál legyeknek. Céljuk az volt, hogy bebizonyítsák, hogy módszerük könnyen használható gének cseréjére, a testszín gén megfelelő változatának „beütésével”, amely a mutáns legyeket ismét barnává varázsolja.
Dr. Golic és Rong knock-out/in technikája egy közös molekuláris szálon múlik, amely áthalad a biológiai birodalmon: a DNS töredezett részei nem lógnak sokáig – gyorsan „rekombinálódnak”, vagy visszavarródnak a genomba.
Dr. Rong kihasználta a legyek molekuláris páncéljának ezt a rését, azzal az érveléssel, hogy ha szándékosan elő tudná hozni a "sárga" testszín gén hibamentes változatát, amely törött végeket tartalmazna, akkor ez a normál gén rekombinálná, és felváltaná a szinte azonos mutáns változatot. ugyanaz a testszín gén, amely a legyek DNS-ében található. Ez könnyen megtörténik, mert csak az azonos (vagy csaknem azonos) szekvenciájú gének ismerik fel egymást, hogy automatikusan rekombinálódjanak, és hatékonyan helyet cseréljenek egymással.
A testszín gén megfelelő változatának „beütésére” – és a sárga legyek normál barnájára való visszaállítására – Dr. Golic és Rong a testszín gén normál, hibamentes változatát vették át, és kissé módosították a beütési eljáráshoz.
Az egyetlen dolog, ami különbözik a normál testszín géntől, hogy Drs. A Golic és a Rong molekuláris "levágási utasítások" jelenlétét használta, amelyek lehetővé tették a gén levágását egy speciális enzimpárral, amelyeket a kutatók a legyekbe is beépítettek.
A csapat ezután a gént a legyek tesztcsoportjába juttatta.
Az általuk használt stratégia – a légykutatók körében szokásos – véletlenszerűen helyezi a gént a legyek kromoszómáiba, ami a gének legyekbe történő bejuttatásának jelenlegi módszerének hátránya. Ez a kulcsfontosságú korlát a múltban akadályozta a légykutatókat, mivel nem teszi lehetővé a gének cseréjét, csak továbbiak hozzáadását – és nem egy adott helyen.
Dr. Golic és Rong ezután ugyanazon legyekbe vezette be a szükséges molekuláris varróeszközök előállításához szükséges utasításokat: két különböző pár genetikai "ollót". Ezek egyike kivágja a beillesztett gént a legyek DNS-én belüli véletlenszerű helyéről, majd körbe varrja a gént. Egy másik ollót arra terveztek, hogy levágja ezt a DNS-kört, ami "szakadt" végeket eredményez. Az olló feletti irányítás érdekében a csapat megalkotta az olló génjét, hogy az egy rövid hőimpulzus (úgynevezett hősokk) után bekapcsolható legyen.
A rossz testszín gén helyettesítéséhez a megfelelőre, Drs. Golic és Rong felmelegítették a legyeket, bekapcsolták a molekulaollót, és elindították a vágási események sorozatát, amely a normál testszín gén DNS-ének egy pár törött végében csúcsosodott ki. A legyek sejtrendszere gyorsan reagált, és a törött végű gént a légygenomba varrta, és a gén korábbi, rossz másolatát a laboratóriumilag tervezett helyes változatra cserélte.
Voila – a legyek következő generációja, amely a testszín gén normál változatát tartalmazza, barnára vált.
Ugyanez a stratégia természetesen ugyanilyen könnyen megfordítható, így a légykutatók olyan mutáns legyeket hozhatnak létre, amelyek egyetlen rossz kópiát tartalmaznak – a megfelelő másolat helyettesítésére tervezve – bármely vizsgálni kívánt génből. Ez a megközelítés lehetővé teszi a tudósok számára, hogy meghatározzák azon gének funkcióit, amelyek szekvenciája önmagában ismert – és ezek alkotják a légygének túlnyomó többségét.
